ELISA三种常见测定方法及原理分析
1、直接ELISA、间接ELISA和竞争性ELISA是三种常见的ELISA测定方法，它们具有不同的原理和特点，适用于不同的实验需求。在实际应用中，应根据目标物质的特点和实验要求选择合适的ELISA测定方法。
2、直接ELISA：原理：直接检测样品中的目标物质。通过将目标物质特异性抗体固定在固相载体上，加入待测样品后，样品中的目标物质与抗体结合。再加入酶标记的抗体与已结合的目标物质反应，形成抗体目标物质酶标记抗体的复合物。最后加入底物，酶催化底物产生颜色变化，通过测定颜色强度来定量目标物质。
3、夹心法：分为直接夹心和间接夹心。检测抗体是酶标抗体时称为直接夹心ELISA；检测抗体不带有标记时，还需使用酶标二抗与检测抗体结合，称为间接夹心ELISA。常用于抗原测定，适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。但抗原需拥有两个以上的抗体结合部位。
4、新冠感染血清抗体检测方法主要有酶联免疫吸附试验、化学发光免疫分析法、胶体金免疫层析法三种。酶联免疫吸附试验（ELISA）：其原理基于抗原抗体特异性结合反应。将抗原或抗体结合到固相载体表面，加入待测血清后，若血清中存在相应抗体，便会与固相载体上的抗原结合，再通过酶催化底物显色来检测抗体。
ELISA步骤、试剂及注意事项
抗原、抗体和酶标记抗体：用于实验的主要试剂。正常人血清和阳性对照血清：用于实验对照。注意事项 实验控制：正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。若本底较高，可采用羊血清、兔血清或BSA等进行封闭。
注意事项： 实验控制：确保实验条件的一致性和可控性，使用阳性与阴性对照，样品应有备份以防意外。 试剂选择：选择合适的固相载体、抗体包被条件、酶标记抗体浓度和底物供氢体，这些选择会直接影响实验结果的准确性和灵敏度。 安全操作：实验过程中注意安全，避免直接接触有毒或腐蚀性试剂。
注意事项： 对照设置：实验前应设置阳性对照与阴性对照，每个待检样品需进行两次检测。 固相载体选择：考虑其吸附性能，常用40孔聚苯乙烯凹孔板。 包被抗体选择：注意纯度、吸附条件及蛋白质浓度。 酶标记抗体浓度：应通过初步滴定或方阵法确定工作浓度。
ELISA实验技巧汇总篇
1、ELISA实验技巧汇总 常用的ELISA方法直接法：将抗原固定于ELISA板上，然后用酶标抗体直接检测抗原。优点在于实验步骤少，检测速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反应，检测结果不容易出错。但缺点是实验背景较高，且由于未使用二抗，信号未被放大，降低了测定的灵敏度。
2、解剖前准备：细节决定成败器材消毒：镊子、剪刀等工具需彻底消毒，仅用酒精擦拭未灼烧易导致样本污染。曾因未灼烧镊子，血清检测出现细菌污染，实验报废。小鼠禁食禁水：取血前禁食12小时，但需保证饮水。若忘记禁水，小鼠脱水会导致血液黏稠，心脏取血时血流不畅，血清量减少一半。
3、实验技巧：蛋白样品制备前确定该蛋白表达丰度，在实验中摸索最佳的上样量。裂解细胞时去培，清洗后直接加入裂解液，轻轻拍打充分浸润，低温摇床裂解半小时；或将细胞刮下，转移至小离心管，转移至冰上裂解半小时，可有效避免胰酶对细胞的过度消化，造成大量胞内蛋白流失。
4、总结与改进 在解决测定值与文献中相差太大的问题时，应总结经验教训，改进实验方法和操作技巧。同时，也可以考虑使用更精确、更灵敏的测定方法或仪器来提高测定值的准确性。
5、技术手段：包括实时PCR、蛋白质印迹、ELISA、成像和细胞病理学显微镜等技术，提供对类器官状态和功能的深入洞察。实验结果：分析阶段通常能够产生有说服力的实验结果，对于理解疾病机制、开发个性化治疗方案具有重要意义。
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